Emergence and clonal expansión of Klebsiella pneumoniae ST307, simultaneously producing KPC-3 and NDM-1

Abstract MDR Klebsiella pneumoniae ST307 is a high-risk clone, whose genetic features contribute to its adaptation to hospital environments and the human host. This study describesthe emergence and clonal dissemination of K. pneumoniae ST307, recovered during November2018 to February 2019 in a hospital in Buenos Aires city, which concurrently harbored KPC-3and NDM-1. These isolates were resistant to all -lactams and to the ceftazidime/avibactamcombination. Molecular studies showed that blaKPC-3was located in Tn4401a platform, whileblaNDM-1was surrounded upstream by ISKpn14 followed by a partial sequence of ISAba125 anddownstream by bleMBL-trpF, located in a 145.5 kb conjugative plasmid belonging to the Inc A/Cgroup. The dissemination of K. pneumoniae ST307 isolates co-producing KPC-3 and NDM-1 couldlead to a worrisome scenario due to the remarkable features of this clone and its resistanceprofile.

Resumen Klebsiella pneumoniae ST307 es un clon de alto riesgo, cuyas características genéticas contribuyen a su adaptación al entorno hospitalario y al huésped humano. Este estudio describe la emergencia y diseminación clonal de aislamientos de K. pneumoniae ST307 productores de KPC-3 y NDM-1, recuperados en un hospital de Buenos Aires. Estos aislamientos fueron resistentes a todos los p-lactámicos y a la combinación ceftacidima/avibactam. Los estudios moleculares evidenciaron que el contexto genético de blaKPC-3 se correspondió con el Tn4401a, mientras que blaNDM-1 estuvo flanqueado corriente arriba por ISKpn14 y una secuencia parcial de ISAba125 y corriente abajo por bleMBL - trpF, localizado a su vez en un plásmido conjugativo de 145.5 kb perteneciente al grupo Inc A/C. La emergencia de aislamientos de K. pneumoniae ST307 coproductores de KPC-3 y NDM-1 pone de manifiesto una situación altamente preocupante debido a las características de este clon y a su perfil de multirresistencia.

Report of two events of nosocomial outbreak and pseudo-outbreak due to contamination with Achromobacter spp / Comunicación de 2 eventos de brote y seudobrote nosocomial debido a contaminación con Achromobacter spp

Abstract Achromobacter spp. are increasingly recognized as emerging pathogens in immunocompromised patients or suffering cystic fibrosis, but unusual in immunocompetent hosts or individuals that underwent surgery. In this study we describe two simultaneous events attributable to two different Achromobacter spp. contaminated sources. One event was related to an episode of pseudo-bacteremia due to sodium citrate blood collection tubes contaminated with Achromobacter insuavis and the other to Achromobacter genogroup 20 infection and colonization caused by an intrinsically contaminated chlorhexidine soap solution. Both threatened the appropriate use of antimicrobials. Molecular approaches were critical to achieving the accurate species identification and to assess the clonal relationship, strengthening the need for dedicated, multidisciplinary and collaborative work of microbiologists, specialists in infectious diseases, epidemiologists and nurses in the control of infections to clarify these epidemiological situations.

Resumen Achromobacter spp. son reconocidas con mayor frecuencia como patógenos emergentes en pacientes con fibrosis quística e inmunodeprimidos, pero son inusuales en hospedadores inmunocompetentes o quirúrgicos. En este estudio describimos 2 eventos simultáneos atribuibles a 2 fuentes contaminadas con Achromobacter spp. Uno correspondió a un episodio de seudobacteriemia por tubos de citrato de sodio contaminados con Achromobacter insuavis y el otro a infecciones y colonizaciones debidas al uso de solución jabonosa de clorhexidina intrínsecamente contaminada con Achromobacter genogrupo 20. Ambos episodios pusieron en peligro el uso apropiado de antimicrobianos. Los enfoques moleculares fueron fundamentales para lograr la identificación precisa de las especies y evaluar la relación clonal de los aislamientos, lo que refuerza la necesidad del trabajo perseverante y multidisciplinario de microbiólogos, especialistas en enfermedades infecciosas, epidemiólogos y enfermeras en el control de infecciones para el esclarecimiento de estas situaciones epidemiológicas.

Full characterization of plasmids from Achromobacter ruhlandii isolates recovered from a single patient with cystic fibrosis (CF) / Caracterización completa de plásmidos provenientes de aislamientos de Achromobacter ruhlandii recuperados de un único paciente con fibrosis quística

Abstract In the last decade Achromobacter spp. has been associated with chronic colonizationin patients with cystic fibrosis (CF). Although Achromobacter xylosoxidans is the most frequentspecies recovered within this genus, other species such as A. ruhlandii have also been reportedin these patients. Descriptions of mobile elements are scarce in Achromobacter and none ofthem have been originated in A. ruhlandii. The aim of this study was to report the full char-acterization of a plasmid which was maintained in four clonally related A. ruhlandii isolates.Between 2013 and 2015, nine A. ruhlandii isolates were recovered from a pediatric patientwith CF at a hospital in Buenos Aires. Four selected clonally related isolates were sequencedby Illumina MiSeq, annotated using RAST and manually curated. The presence of a unique plas-mid of 34096-bp and 50 CDS was observed in the four isolates, displaying only 1 nucleotidesubstitution translated into one amino acid change among them. These plasmids have a class 1integron containing the aac-(6)-Ib gene, a mercury resistance operon region and the relE/stbEtoxin/antitoxin system. Plasmids showed 79% similarity and 99% identity with pmatvim-7 fromPseudomonas aeruginosa. This is the first full description and characterization of a plasmid fromA. ruhlandii which was maintained over time.

Resumen Durante la última década, Achromobacter spp. han sido asociadas con la colonización crónica en pacientes con fibrosis quística. Si bien Achromobacter xylosoxidans es la especie más frecuentemente recuperada, otras especies como Achromobacter ruhlandii también fueron reportadas en nuestra región. Sin embargo, pocos reportes se han centrado en la descripción de elementos móviles, y ninguno de ellos los documenta en A. ruhlandii. El objetivo de este estudio fue reportar la caracterización completa de un plásmido conservado en 4 aislamientos clonalmente relacionados de A. ruhlandii. Se recuperaron 9 aislamientos de A. ruhlandii entre 2013 y 2015 de un único paciente con fibrosis quística proveniente de un hospital pediátrico de Buenos Aires, Argentina. Se realizó la secuenciación completa del genoma de los 4 aislamientos seleccionados según el perfil de resistencia antibiótica en un equipo Illumina MiSeq. Estos fueron anotados mediante RAST y curados manualmente. Se detectó la presencia de un solo plásmido de 34.096 pb y 50CDS en los 4 aislamientos, observándose únicamente un cambio nucleotídico traducido en un cambio aminoacídico en un aislamiento. Los plásmidos ensamblados se caracterizaron por presentar un integrón de clase 1 que contenía el gen aac-(6')-Ib, un operón de resistencia a mercurio y el sistema de toxina-antitoxina relE/stbE. Cabe destacar que estos plásmidos poseen un 79% de similitud y un 99% de identidad con el plásmido pmatvim-7 de Pseudomonas aeruginosa. Esta es la primera descripción y caracterización completa de un plásmido proveniente de A. ruhlandii.

Full characterization of an IncR plasmid harboring qnrSI recovered from a VIM-11-producing Pseudomonas aeruginosa

Abstract Metallo-p-lactamases (MBL) producing Pseudomonas aeruginosa isolates have been well characterized. Quinolones are commonly used in the treatment of carbapenem-resistant P. aeruginosa infections; however, data about PMQR in this species are scarce. The objective of this study was to report the simultaneous presence of qnrS and blaV-M-n in P. aeruginosa, and to characterize the qnrS-harboring plasmid. Thirty-eight carbapenem-resistant P. aeruginosa isolates were recovered from a hospital in Buenos Aires during 2012. Screening forMBL was assessed by the double disk synergy test using EDTA and carbapenem discs. Plasmid DNA extraction was performed by a method using phenol-chloroform. PCR followed by sequencing was carried out to determine each MBL and PMQR allele. PCR-BseGI-RFLP was performed to detect aac-(6')-Ib-cr. The gyrA-QRDR was sequenced in those PMQR-harboring isolates. Plasmid incompatibility groups and addiction systems were characterized by PCR. The PMQR-carrying plasmid was sequenced using Illumina technology, annotated using RAST and manually curated. Eleven/38 isolates were VIM producers (blaVIM-2 and blaVIM-11) while 1/38 harbored blaIMP-13. One isolate harbored blaVIM-11 and the PMQR qnrSI; however, both markers were located in different plasmids. The qnrSí-harboring plasmid (pP6qnrS1) was 117 945 bp in size, presented 154 CDS and corresponded to the IncR group. In addition to qnrSI, it harbored several aminoglycoside resis-tance markers. Although pP6qnrS1 was non-conjugative, it presented an oriT which made it possible for this plasmid to be transferable. This is the first report on P. aeruginosa carrying both blaVIM-11 and qnrSI, plus the first detection of an IncR plasmid in Argentina.

Resumen Las quinolonas son comúnmente utilizadas en el tratamiento de las infecciones producidas por Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenems (PARC); aun así, la información sobre la resistencia a quinolonas mediada por plásmidos (PMQR) en esta especie es escasa. El objetivo de este trabajo fue reportar la presencia simultánea de los genes qnrS y blaVIM-11 en PARC y caracterizar el plásmido portador de qnrS. Durante 2012 se recuperaron 38 PARC en un hospital de Buenos Aires. El tamizaje para detectar producción de metalo-beta-lactamasas (MBL) se llevó a cabo mediante sinergia de doble disco utilizando EDTA y carbapenems. El ADN plasmídico fue extraído utilizando fenolcloroformo. Para determinar los alelos de los genes implicados en la síntesis de MBL y de PMQR, se llevó a cabo PCR-secuenciación. Para la detección de aac-(6')-Ib-cr se realizó PCR-BseGI-RFLP. En aquellos aislamientos portadores de PMQR se secuenció el gen gyrA. Los grupos de incompatibilidad y sistemas de adicción fueron caracterizados por PCR. El plásmido portador de PMQR fue secuenciado completamente y curado manualmente. De 38 aislamientos, 11 fueron productores de VIM (blaVIM-2 y blaVIM-11), mientras que uno contenía blaIMP-13. Si bien un aislamiento fue portador de blaVIM-11 y de qnrSI, dichos marcadores se encontraban en distintos plásmidos. El plásmido portador de qnrSI (pP6qnrS1) presentó un tamaño de 117.945 pby 154 secuencias codificantes (CDS); este correspondió al grupo de incompatibilidad IncR. Además de qnrSI, el plásmido portaba diversos marcadores de resistencia a aminoglucósidos. Aun cuando pP6qnrS1 no resultó conjugativo, presentó un oriT, de modo que posiblemente sea transferible. Este es el primer informe acerca de PARC portadora de blaVIM-11 y de qnrSI en simultáneo, además, es la primera descripción de un plásmido IncR en Argentina.

Diversity of Achromobacter species recovered from patients with cystic fibrosis, in Argentina / Diversidad de las especies de Achromobacter recuperadas de pacientes con fibrosis quística en Argentina

Abstract Different phenotype-based techniques and molecular tools were used to describe the distribution of different Achromobacter species in patients with cystic fibrosis (CF) in Argentina, and to evaluate their antibiotic resistance profile. Phenotypic identification was performed by conventional biochemical tests, commercial galleries and MALDI-TOF MS. Genetic approaches included the detection of A. xylosoxidans specific marker blaoxa-114, the amplificaron and sequencing of the 16S rRNA gene, nrdA and blaOXA complete sequence, and MLST analysis. Phenotypic approaches, even MALDI-TOF, rendered inconclusive or misleading results. On the contrary, concordant results were achieved with the nrdA sequencing or sequence type (ST) analysis, and the complete blaOXA sequencing, allowing a reliable discrimination of different Achromobacter species. A. xylosoxidans accounted for 63% of Achromobacter infections and A. ruhlandii accounted for 17%. The remaining species corresponded to A. insuavis, A. dolens, A. marplatensis and A. pulmonis. Antimicrobial susceptibilities were determined by the agar dilution method according to CLSI guidelines. Piperacillin, piperacillin/tazobactam and car-bapenems were the most active antibiotics. However, the emergence of carbapenem-resistant isolates was detected. In conclusion, prompt and accurate identification tools were necessary to determine that different Achromobacter species may colonize/infect the airways of patients with CF. Moreover, antimicrobial therapy should be administered based on the susceptibility profile of individual Achromobacter sp. isolates. © 2019 Asociación Argentina de Microbiología. Published by Elsevier España, S.L.U. This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Resumen Se emplearon diversas técnicas fenotípicas y moleculares para describir la distribución de diferentes especies del género Achromobacter en pacientes con fibrosis quística (FQ) en Argentina, y se evaluó el perfil de resistencia a los antibióticos. Se realizó la identificación fenotípica por pruebas bioquímicas convencionales, galerías comerciales y MALDI-TOF MS. El enfoque genético incluyó la detección del marcador especie-específico de A. xylosoxidans bla[PRESERVECIRC]tu, la amplificación y la secuenciación de los genes ARNr 16S, nrdA y secuencia completa de blaOXA, y el análisis por MLST. Los enfoques fenotípicos, incluso la técnica de MALDI-TOF, proporcionaron resultados no concluyentes o erróneos. Por el contrario, se obtuvieron resultados concordantes entre la secuenciación del gen nrdA o el análisis de secuenciotipos (ST) y la secuenciación completa de blaOXA, lo que permitió una discriminación confiable de las diferentes especies de Achromobacter. A. xylosoxidans representó el 63% de las infecciones por Achromobacter y A. ruhlandii representó el 17%. Las especies restantes correspondieron a A. insuavis, A. dolens, A. marplatensis y A. pulmonis. Se determinó la sensibilidad a antimicrobianos por el método de dilución en agar de acuerdo al CLSI. Los antibióticos más activos fueron piperacilina, piperacilina/tazobactam y carbapenemes. Sin embargo, se detectó la emergencia de aislamientos resistentes a carbapenemes. En conclusión, resultaron necesarias herramientas de identificación rápida y precisas para determinar las diferentes especies del género Achro-mobacter capaces de colonizar/infectar las vías respiratorias de los pacientes con FQ. Asimismo, la terapia antimicrobiana debería llevarse a cabo en función del perfil de sensibilidad de los aislamientos individuales de Achromobacter spp. © 2019 Asociacion Argentina de Microbiología. Publicado por Elsevier Espana, S.L.U. Este es un artículo Open Access bajo la licencia CC BY-NC-ND (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Primer relevamiento de marcadores de resistencia a antibióticos en Enterobacteriaceae en Cochabamba, Bolivia / First survey on antibiotic resistance markers in Enterobacteriaceae in Cochabamba, Bolivia

A molecular survey was conducted in Cochabamba, Bolivia, to characterize the mechanism involved in the resistance to clinically relevant antibiotics. Extended Spectrum β-lactamase encoding genes and plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) markers were investigated in a total of 101 oxyimino-cephalosporin-resistant enterobacteria recovered from different health centers during four months (2012-2013). CTX-M enzymes were detected in all isolates, being the CTX-M-1 group the most prevalent (88.1%). The presence of blaOXA-1 was detected in 76.4% of these isolates. A high quinolone resistance rate was observed among the included isolates. The aac(6′)-Ib-cr gene was the most frequent PMQR identified (83.0%). Furthermore, 6 isolates harbored the qnrB gene. Interestingly, qepA1 (6) and oqxAB (1), were detected in 7 Escherichia coli, being the latter the first to be reported in Bolivia. This study constitutes the first molecular survey on resistance markers in clinical enterobacterial isolates in Cochabamba, Bolivia, contributing to the regional knowledge of the epidemiological situation. The molecular epidemiology observed herein resembles the scene reported in South America.

Se llevó a cabo un relevamiento molecular de la resistencia a antibióticos de importancia clínica en aislamientos recuperados en Cochabamba, Bolivia. Se estudiaron los genes codificantes de β-lactamasas de espectro extendido y de resistencia a quinolonas de localización plasmídica (PMQR) en un total de 101 aislamientos de enterobacterias resistentes a oximinocefalosporinas recuperados en distintos centros de salud, durante 4 meses (2012-2013). En todos ellos se detectó la presencia de cefotaximasas, las CTX-M grupo 1 fueron las más prevalentes (88,1%). La presencia de blaOXA-1 se detectó en el 76,4% de estos aislamientos. Se observó una elevada proporción de aislamientos resistentes a quinolonas. El gen aac(6′)-Ib-cr fue el determinante PMQR más frecuentemente identificado (83%). Además, 6 aislamientos resultaron ser portadores de qnrB. Por otro lado, cabe remarcar que 7 Escherichia coli presentaron qepA1 (6) y oqxAB (1); se documenta así por primera vez la presencia de oqxAB en Bolivia. Este estudio constituye el primer relevamiento de marcadores de resistencia en aislamientos clínicos de enterobacterias en Cochabamba, Bolivia; de este modo se contribuye al conocimiento regional de la situación epidemiológica, la cual presenta un escenario similar al observado en el resto de Latinoamérica.

Draft genome sequence of Inquilinus limosus strain MP06, a multidrug-resistant clinical isolate

The bacterium, Inquilinus limosus, with its remarkable antimicrobial multiresistant profile, has increasingly been isolated in cystic fibrosis patients. We report draft genome sequence of a strain MP06, which is of considerable interest in elucidating the associated mechanisms of antibiotic resistance in this bacterium and for an insight about its persistence in airways of these patients.

Antibiotic resistance and integrons in Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC)

Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) cause hemorrhagic colitis (HC) and hemolytic-uremic syndrome in humans (HUS). Cattle are the main reservoir of STEC and transmission to humans occurs through contaminated food and water. Antibiotics are used in pig production systems to combat disease and improve productivity and play a key role in the dissemination of antibiotic resistance genes to the bacteria. Integrons have been identified in resistant bacteria allowing for the acquisition and dissemination of antibiotic resistance genes. STEC strains isolated from humans and animals have developed antibiotic resistance. In our laboratory, 21 non-157 STEC strains isolated from pigs were analyzed to detect class 1 and 2 integrons by PCR. Eight carried integrons, 7 of them harbored intl2. In another study 545 STEC strains were also analyzed for the presence of intl1 and intl2. Strains carrying intl1 belonged to isolates from environment (n = 1), chicken hamburger (n = 2), dairy calves (n = 4) and pigs (n = 8). Two strains isolated from pigs harbored intl2 and only one intl1/intl2, highlighting the presence of intl2 in pigs. The selection for multiresistant strains may contribute to the emergence of antibiotic resistant pathogens and facilitate the spreading of the mobile resistance elements to other bacteria.

ß-lactamases produced by amoxicillin-clavulanate-resistant enterobacteria isolated in Buenos Aires, Argentina: A new blaTEMgene / ß-lactamasas producidas por enterobacterias resistentes a amoxicilina-ácido clavulánico aisladas en Buenos Aires, Argentina: un nuevo gen blaTEM

La resistencia a la combinación de ß-lactámico/inhibidor de ß-lactamasa en enterobacterias es un problema creciente que no ha sido estudiado intensamente en Argentina. En el presente trabajo, 54/843 enterobacterias recolectadas en un hospital universitario de la ciudad de Buenos Aires fueron resistentes a ampicilina-sulbactama, pero se mantuvieron sensibles a las cefalosporinas de segunda y tercera generación. Se analizaron los mecanismos enzimáticos presentes en los aislamientos que también fueron resistentes a amoxicilina-ácido clavulánico (AMC) (18/54). La secuenciación reveló dos variantes diferentes de blaTEM-1, donde blaTEM-1b es el alelo más frecuentemente detectado (10 Escherichia coli, 3 Klebsiella pneumoniae, 2 Proteus mirabilis y 1 Raoultella terrigena), seguidos por blaTEM-1a(1 K. pneumoniae). La resistencia a AMC parece estar asociada principalmente con la hiperproducción de TEM-1 (sobre todo en E. coli) o con la coexpresión con ß-lactamasas tipo OXA-2 y/o SHV (K. pneumoniae y P. mirabilis). Se describió una nueva variante de blaTEM(TEM-163) en un aislamiento de E. coli que presentó una CIM frente a AMC de 16/8 µg/ml. La enzima TEM-163 contiene dos sustituciones de aminoácidos respecto de TEM-1, Arg275Gln y His289Leu. Teniendo en cuenta la alta actividad específica observada y la baja IC50 para el ácido clavulánico, el patrón de resistencia de este aislamiento parece obedecer a la hiperproducción de la nueva variante de la ß-lactamasa de amplio espectro, en lugar de vincularse con un comportamiento similar al de una TEM resistente a inhibidores (IRT).

Resistance to ß-lactam/ß-lactamase inhibitors in enterobacteria is a growing problem that has not been intensively studied in Argentina. In the present work, 54/843 enterobacteria collected in a teaching hospital of Buenos Aires city were ampicillin-sulbactam-resistant isolates remaining susceptible to second-and third-generation cephalosporins. The enzymatic mechanisms present in the isolates, which were also amoxicillin-clavulanic acid (AMC)-resistant (18/54) were herein analyzed. Sequencing revealed two different variants of blaTEM-1, being blaTEM-1b the most frequently detected allelle (10 Escherichia coli, 3 Klebsiella pneumoniae, 2 Proteus mirabilis and 1 Raoultella terrigena) followed by blaTEM-1a(1 K. pneumoniae). Amoxicillin-clavulanate resistance seems to be mainly associated with TEM-1 overproduction (mostly in E. coli) or co-expressed with OXA-2-like and/or SHV ß-lactamases (K. pneumoniae and P. mirabilis). A new blaTEMvariant (TEM-163) was described in an E. coli strain having an AMC MIC value of 16/8 µg/ml. TEM-163 contains Arg275Gln and His289Leu amino acid substitutions. On the basis of the high specific activity and low IC50 for clavulanic acid observed, the resistance pattern seems to be due to overproduction of the new variant of broad spectrumß-lactamase rather than to an inhibitor-resistant TEM (IRT)-like behavior.

Primera detección de CMY-2 en Salmonella Heidelberg en Sudamérica / First detection of CMY-2 plasmid mediated ß-lactamase in Salmonella Heidelberg in South America

Salmonellaenterica serovar Heidelberg es uno de los principales agentes causantes de salmonelosis en humanos en Estados Unidos y Canadá, sin embargo, resulta infrecuente en los países de Sudamérica y Europa. En este trabajo se caracterizó un aislamiento de S. Heidelberg resistente a oximino-cefalosporinas recuperado de un paciente internaen un hospital de la Ciudad de Buenos Aires. Se evidenció la presencia de un plásmido de 97 kbperteneciente al grupo de incompatibilidad IncN, portador del gen blaCMY-2. ISEcp1 fue localizado corriente arriba de blaCMY-2, promoviendo su expresión y movilización.El aislamiento de S. Heidelberg correspondió al secuenciotipo 15 y en la virotipifi cación se detectó el gen sopE. En este trabajo describimos por primera vez la producción de CMY-2 en una cepa de S. Heidelberg en nuestro país y América Latina

Salmonellaenterica serovar Heidelberg ranks among the most prevalent causes of human salmonellosis in the United States and Canada, although it has been infrequently reported in South American and European countries.Most Salmonella infections are self-limiting; however, some invasive infections require antimicrobial therapy. In this work we characterized an oxyimino-cephalosporin resistant S. Heidelberg isolate recovered from an inpatient in a Buenos Aires hospital. CMY-2 was responsible for the ß-lactam resistance profi le. S. Heidelberg contained a 97 kb plasmid belonging to the Inc N groupharboring blaCMY-2. ISEcp1 was located upstream blaCMY-2 driving its expression and mobilization.The isolate belonged to sequence type 15 and virotyping revealed the presence of sopE gene. In this study we identifi ed the fi rst CMY-2 producing isolate of S. Heidelberg in Argentina and even in South Americ

IS CR1 asociado con genes blaCTX-M-1 y bla CTX-M-2 en plásmidos IncN e IncFIIA aislados en Klebsiella pneumoniae de origen hospitalario en Mérida, Venezuela / IS CR1 associated with bla CTX-M-1 y bla CTX-M-2 genes in IncN and IncFIIA plasmids isolated from Klebsiella pneumoniae of nosocomial origin in Mérida, Venezuela

Introducción. Las secuencias de inserción tales como IS CR1 promueven la captura, transposición y expresión de los genes bla CTX-M, facilitando, de esta manera, su diseminación rápida en la población bacteriana. Objetivo. Se determinó la presencia del elemento IS CR1 y su asociación con genes bla CTX-M-1 y bla CTX-M-2 en plásmidos de diferentes grupos de incompatibilidad en Klebsiella pneumoniae de origen hospitalario. Materiales y métodos. Se aislaron tres cepas de K. pneumoniae con sensibilidad disminuida a cefalosporinas de amplio espectro, de neonatos con septicemia hospitalaria. La presencia de β -lactamasas de espectro expandido (BLEE) fue determinada fenotípicamente. Los plásmidos se aislaron y clasificaron según grupos de incompatibilidad por tipificación del replicón por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los genes bla BLEE y su asociación a IS CR1 se determinaron por PCR y secuenciación directa, usando varios juegos de iniciadores. Resultados. Todas las cepas demostraron un perfil fenotípico indicativo de producción de BLEE, transferibles por conjugación. Los ensayos de PCR para para cefotaximasas (CTX-M) y el análisis de la secuenciación, revelaron que las cepas portaban genes bla CTX-M-1 y bla CTX-M-2. Estos genes se encontraron en plásmidos conjugados de 150 kb, aproximadamente, relacionados con los grupos IncN e IncFIIA, respectivamente. IS CR1 se encontró ´aguas arriba´ ( upstream ) y asociado con los genes bla CTX-M-1 y bla CTX-M-2. Conclusión. Este es el primer reporte realizado en Venezuela donde la presencia de IS CR1 está estrechamente asociada con la movilización de los genes bla CTX-M-1 y bla CTX-M-2 en plásmidos conjugativos IncN y IncFIIA en cepas de K. pneumoniae que circulan en una Unidad de Alto Riesgo Neonatal.

Introduction: Insertion sequences such as IS CR1 promote capture, transposition and expression of bla CTX-M genes. Thus, gene dissemination in bacterial populations occurs rapidly. Objective: To determine the presence of IS CR1 sequence genes and their association with bla CTX-M-1 and bla CTX-M-2 on plasmids IncN and IncFIIA from K. pneumoniae of nosocomial origin, was determined. Materials and methods: Three strains of K. pneumoniae with reduced susceptibility to extendedspectrum cephalosporins were isolated from neonatal sepsis cases of nosocomial origin. Phenotypic tests showed the presence of ESBLs. Plasmids were isolated and classified according to incompatibility groups by PCR replicon typing. Detection and association of IS CR1 with bla CTX-M genes were determined by PCR and direct sequencing through the use of several sets of PCR primers. Results: All strains showed phenotypic profile consistent with ESBL-producing transferred by conjugation. PCR amplification assay for CTX-M together with sequencing analysis revealed that strains carrying bla CTX-M-1 y bla CTX-M-2 genes were localized in plasmids of approximately 150 kb related to IncN and IncFIIA groups, respectively. IS CR1 was found upstream and associated with bla CTX-M-1 y bla CTX-M-2 genes. Conclusion. Thus far, this is the first Venezuelan report, in which IS CR1 presence is closely related to bla CTX-M-1 y bla CTX-M-2 gene mobilization in IncN and IncFIIA conjugative plasmids located in K. pneumonaiae strains circulating at a neonatal high risk unit.

Dos aislamientos de Salmonella Infantis multirresistentes se comportan como hipoinvasivos pero con elevada proliferación intracelular

En este trabajo se investigó la presencia de determinantes característicos de plásmidos de virulencia en dos aislamientos clínicos de Salmonella Infantis portadores de plásmidos de multirresistencia. Además, se estudió la capacidad de invasión y proliferación en células eucariotas no fagocíticas. Ninguno de los aislamientos de S. Infantis mostró los determinantes genéticos que caracterizan a los plásmidos de virulencia para este género (operón spv). Los ensayos de invasión sobre líneas celulares eucariotas mostraron que los aislamientos de S. Infantis presentan una capacidad de invasión disminuida pero persisten y proliferan en el citoplasma, independientemente de utilizar una línea celular permisiva (HeLa) o no permisiva (NRK) para tal fin. Finalmente, no se observaron indicios microscópicos que podrían hacer sospechar un efecto bactericida de estas líneas celulares sobre los aislamientos estudiados.

Two multidrug-resistant Salmonella Infantis isolates behave like hypo-invasive strains but have high intracellular proliferation. In this work, plasmid-encoded virulence factors in two Salmonella Infantis isolates carrying multiresistance plasmids were investigated. In addition, their invasion and proliferative ability in non-phagocytic cells was studied. None of them showed the typical determinants of virulence plasmids (spv operon). The invasion assays of S. Infantis isolates on eukaryotic cells showed a decreased ability to Invade but they remained and proliferated In the cytoplasm regardless of having used a permissive (HeLa) or non-permissive (NRK) cell line. Finally, there was no microscopic evidence suggesting a bactericidal effect of these eukaryotic cell lines on the Isolates tested.

Resistencia a carbapenemes en aislamientos de pseudomonas aeruginosa: un ejemplo de interacción entre distintos mecanismos / Carbapenem resistance in pseudomonas aeruginosa isolates: an example of interaction between different mechanisms

Objetivo. Identificar la proteína de membrana externa ausente en los aislamientos resistentes y determinar tanto las causas de su ausencia en la membrana, como la presencia de otros mecanismos de resistencia a carbapenemes en aislamientos clínicos de Pseudomonas aeruginosa. Métodos. Se estudió un brote de 20 aislamientos de P. aeruginosa previamente caracterizados como productores de la metalobetalactamasa IMP-13. Estos aislamientos presentaron igual expresión de la enzima IMP-13, pero solo cinco de ellos fueron resistentes acarbapenemes. En esos cinco aislamientos resistentes se confirmó la ausencia de una proteína de membrana externa. Se secuenciaron oprD y ampC; se identificaron las proteínas de membrana externa por desorción/ionización láser asistida por matriz/espectometría de masa tiempo de vuelo (MALDI-TOF); se determinó el nivel de expresión de OprD, de AmpC y de los sistemas de eflujo tipo Mex, por reacción en cadena de polimerasa en tiempo real, y por último, se determinó la contribución del déficit de OprD a la resistencia a carbapenemes. Resultados. La proteína de la membrana externa ausente en el grupo R (resistentes a ambos carbapenemes) fue identificada como OprD-TS, pero no se observaron variaciones en suexpresión. El gen oprD presentó mutaciones en los cinco aislamientos resistentes. Se observó la misma producción de la enzima tipo AmpC PDC-5 y del sistema de eflujo Mex AB-OprM entre los aislamientos sensibles y resistentes a carbapenemes. Se analizó cómo la presencia conjunta de IMP-13 y el déficit de OprD contribuyen al aumento de la resistencia.Conclusiones. Distintos mecanismos contribuyen a la resistencia de aislamientos productores de IMP-13 a carbapenemes. La posibilidad de no detectar estos aislamientos productores de IMP-13 representa un riesgo latente de selección de mutantes con mecanismos de resistencia que se suman para aumentar la resistencia a carbapenemes.

Objective. To identify the outer membrane protein absent in the resistant isolates and to determine both the causes of its absence in the membrane and the presence of othermechanisms of carbapenem resistance in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Methods. Twenty isolates from an outbreak of P. aeruginosa previously characterized as metallo-beta-lactamase IMP-13 producers were studied. All the isolates exhibitedequal expression of the IMP-13 enzyme, but only five of them were carbapenemresistant. It was found that the five resistant isolates lacked a outer membrane protein. The oprD and ampC genes were sequenced; the outer membrane proteins were identifiedusing matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry; the OprD and AmpC expressions, as well as the Mex efflux system, were assessed by real-time polymerase chain reaction; and finally, the contribution of reduced OprD to carbapenem resistance was determined. Results. The absent outer membrane protein in group R was identified as OprD-TS; however, no variations in its expression were observed. The oprD gene presentedmutations in the five resistant isolates. The production of AmpC PDC-5-type enzyme and the MexAB-OprM efflux system was the same in both carbapenem-sensitive and‑resistant isolates. The contribution of the combined presence of IMP-13 and reducedOprD to increased resistance was examined. Conclusions. Different mechanisms contribute to carbapenem resistance in IMP-13-producing isolates. The possibility that these IMP-13-producing isolates could go undetected poses a latent risk when selecting mutants with added resistancemechanisms in order to enhance carbapenem resistance.

Criterios de ensayo, interpretación e informe de las pruebas de sensibilidad a los antibióticos en los bacilos gram negativos no fermentadores de importancia clínica: recomendaciones de la Subcomisión de Antimicrobianos de la Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínicas, Asociación Argentina de Microbiología / Antimicrobial susceptibility testing in clinically relevant non-fermenting gram-negative bacilli: recommendations from the Antimicrobial Agents Subcommittee of the Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínicas, Asociación Argentina de Microbiología

En este documento se dan a conocer una serie de recomendaciones para el ensayo, la lectura, la interpretación y el informe de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos para los bacilos gram negativos no fermentadores (BGNNF) que se aíslan en humanos. Se adoptaron como base las recomendaciones internacionales, las de la Subcomisión de Antimicrobianos de la Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínicas y las de un grupo de expertos invitados. Se incluye, además, la nomenclatura actualizada de los BGNNF y la descripción de algunas de sus características individuales, de sus resistencias naturales o habituales a los antimicrobianos de uso clínico y de los mecanismos responsables de tales resistencias. También se indican los agentes antimicrobianos que se deberían ensayar frente a las distintas especies, con la especificación de cuáles deberían ser informados, y su ubicación estratégica en las placas de cultivo para poder detectar los mecanismos de resistencia más frecuentes y relevantes. Por último, se detallan los métodos de detección y de confirmación fenotípica de la presencia de b-lactamasas emergentes en Argentina, como las carbapenemasas clases A y B.

This document contains the recommendations for antimicrobial susceptibility testing of the clinically relevant non-fermenting gram-negative bacilli (NFGNB), adopted after conforming those from international committees to the experience of the Antimicrobial Agents Subcommittee members and invited experts. This document includes an update on NFGNB classification and description, as well as some specific descriptions regarding natural or frequent antimicrobial resistance and a brief account of associated resistance mechanisms. These recommendations not only suggest the antimicrobial drugs to be evaluated in each case, but also provide an optimization of the disk diffusion layout and a selection of results to be reported. Finally, this document also includes a summary of the different methodological approaches that may be used for detection and confirmation of emerging b-lactamases, such as class A and B carbapenemases.

Susceptibilities to carbapenems and presence of cphA gene on food-borne Aeromonas

The purpose of this study was to determine the susceptibilities of food-borne Aeromonas to carbapenems, as well as to investigate the presence of a metallo carbapenemase-encoding gene, named cphA. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) was determined following NCCLS standards. All the tested microorganisms were susceptible to imipenem, meropenem and biapenem. However, a strong inoculum size effect on carbapenem MICs was observed for most of the strains. Six strains, out of seven, showed the presence of metallo--beta-lactamases but cphA gene was detected in only two strains of A. veronii bv. sobria.

O objetivo deste estudo foi determinar a suscetibilidade de aeromonas de origem alimentar a carbapenems bem como investigar a presença de um gene codificante de metalocarbapenemase, denominado "cph A". A suscetibilidade in vitro foi determinada pelo metodo de diluição em agar. Todas as cepas foram suscetíveis a Imipenem, Meropenem e Biapenem. Porém foi observado um forte efeito de tamanho do inóculo sobre as CIM das carbapenems na maioria das cepas. A detecção de metalo-beta-lactamase foi realizada pelo metodo lodometrico. Seis cepas das sete testadas demostraron a presença da enzima. A presença do gene cphA foi determinada por PCR e foi detectada em duas cepas de A veronii bv. sobria.

Estudio de un brote debido a aislados de Klebsiella pneumoniae productores de betalactamasas de espectro extendido en un centro asistencial de Rosario - Argentina / An outbreak of extended spectrum beta-lactamase Klebsiella pneumoniae producers in a health care center from Rosario - Argentina

En América Latina (AL) son trascendentes los productores de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) en infecciones hospitalarias. Los datos de API y SENTRY revelan una incidencia del 22 a 55. En AL y frecuentemente en el Cono Sur predominan las BLEE de la familia CTX-M contrariamente a EUA y Europa donde prevalecen las derivadas de TEM. Las CTX-M afectan cefotaxima, ceftriaxona y cefepima con más frecuencia que ceftacidima. El tratamiento depende del empleo de carbapenemes con el riesgo de seleccionar resistencia en bacilos gram negativos no fermentadores. El uso de otros betalactámicos particularmente cefepima no es aconsejable por las frecuentes fallas observadas en nuestro medio debido al efecto inóculo por aislados productores de CTX-M-2. Describimos un brote por Klebsiella pneumoniae (Kp) ocurrido entre junio-julio 2004. En el período previo, sólo un paciente presentó una infección debida a Kp productora de BLEE y en el posterior, lo presentaron dos pacientes Se determinó la CIM por microdilución en agar. El fenotipo BLEE se sospechó por ensayo del efecto del clavulanato unido a cefalosporinas de 3ª generación (C3G). Se determinó el punto isoeléctrico (pI) y la detección por PCR del tipo molecular por métodos convencionales. Se comprobaron dos bandas pI 5.4 y 8.2 con ampicilina y ceftriaxona en todas las cepas excepto en dos. Todas las cepas revelaron producción de CTX-M-2 excepto en dos cepas que se identificaron como productoras de SHV-5. Los estudios clonales se correspondieron con los moleculares identificándose dos clones. El brote se resolvió usando dos importantes medidas: 1) lavado de manos y otras medidas de barrera y 2) restringiendo el uso de C3G y ciprofloxacina

Obtención de mutantes dicloxacilina resistentes en Listeria monocytogenes / Isolation of dicloxacillin resistant mutants from Listeria monocytogenes

A partir de la cepa sensible de Listeria monocytogenes ATCC: 15313 se obtuvieron 10 mutantes espontáneas Dicloxacilina resistentes, indiferenciables de la cepa parenteral mediante pruebas bioquímicas convencionales y análisis electroforético de sus perfiles proteicos en presencia de detergentes. La disminución en la susceptibilidad frente a Dicloxacilina no fue en todas las cepas acompañada por una disminución paralela en la susceptibilidad frente a Penicilina G. Estudios morfológicos demostraron que algunas de las mutantes, creciendo a dosis subinhibitorias de Dicloxacilina, presentan profundas alteraciones en su morfología, entre la que se cuenta la formación de estructuras helicoidales